Aplicação do cloreto de trifeniltetrazólio no teste de limite microbiano em medicamentos e cosméticos

n O cloreto de trifeniltetrazólio (TTC) foi empregado neste trabalho visando padronização de método alternativo para o teste de limite microbiano em medicamentos e cosméticos, com redução no tempo de análise, além de possibilitar a aplicação da técnica de semeadura em profundidade em amostras hidroinsolúveis com opacidade e carga contaminante menor que 102 UFC/g (mL).Na técnica de tubos múltiplos, a aplicação do corante não possibilitou a redução do tempo de incubação, pois a sensibilidade para detecção de suspensão bacteriana por meio de coloração do trifenilformazano foi de 108 UFC/mL após 1 hora de reação e 107 UFC/mL após 4 horas, suspensões estas visivelmente turvas. A adição de glicose e ácido glutâmico no meio de caseina-sola, nas concentrações de 0,5% e 0,1%, respectivamente, não aumentou a sensibilidade da reação. O polissorbato 20, adicionado ao meio de cultura, líquido ou sólido, promoveu a difusão do trifenilformazano das células para o meio, fator que não favorece a visualização da massa celular no meio líquido e nem das colônias. A concentração mínima de TTC que resultou em coloração máxima no meio líquido foi de 500 e 1000 μg/mL, dependendo da espécie bacteriana. Entretanto, suspensões bacterianas com 102, 10 e 1 UFC/mL testadas, pela técnica de tubos multiplos, com adição do corante na forma de solução após 20 horas em meio de caseina-soja, forneceram resultados equivalentes, quanto ao número de tubos positivos e negativos frente às duas concentrações. A comparação desta técnica alternativa com a da subcultura demonstrou ser o tempo de 20 horas de incubação insuficientes para detecção pelo TTC, quando inoculadas alíquotas de 1 mL de suspensão com número da ordem de 1 UFC/mL Na técnica de semeadura em profundidade, após incubação de 48 horas, a coloração das colônias bacterianas foi efetuada cobrindo-se a superfície do meio de cultura com 5 mL de ágar a 1,0% contendo TTC. A concentração de 0,025% do corante promoveu a coloração das colônias após 1 hora. Entretanto, na presença de suspensão de hidróxido de alumínio a 6% a concentração mínima eficaz de TTC foi de 0,1%. Para leveduras em meio líquido essa concentração foi de 2.500 μ/mL no meio neutralizado. Em meio sólido, na presença de material opalescente, a concentração eficaz foi de 2,0%, com o TTC adicionado na dispersão de ágar em tampão pH 7,5. Amostras de produtos comercializados com característica opalescente foram submetidas à análise pelo método de tubos múltiplos com sub-cultura e pela revelação com TTC. Simultaneamente as mesmas foram testadas pelo método de semeadura em profundidade, inoculando-se 2 mL das diluições 1:4 e 1:10 com revelação das colônias com o corante. O tempo para obtenção dos resultados foi de 72 horas pelo método oficial e de 50 horas pelo método com TTC, tanto em meio líquido como em sólido. A comparação dos dados obtidos pelos 3 métodos não resultou em diferença significativa para a maioria das amostras testadas. Entretanto, os coeficientes de variação foram sempre menores para o método de semeadura em profundidade com a amostra diluída de 1:4, indicando maior precisão deste sobre os outros, principalmente em relação ao número mais provável.\n

Physics · Antimicrobial agents and applications

• Standard Methods for the Examination of Dairy Products

  A H Robertson, Luther A Black et al.•American Journal of Public Health…•1949

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• Her Majesty's Stationery Office

  D C Dashfield•Parliamentary Affairs•1954

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